Afgelei van cholesterol, vitamien D word gebiosinteteer vanaf sy prohormoon cholecalciferol (D3), die produk van sonkrag ultraviolet bestraling van 7-dehidrocholesterol in die vel. In 1966, daar is eers erken dat vitamien D aktivering moet ondergaan via twee oksidatiewe metaboliese stappe. Die eerste oksidasie na 25-hydroxycholecalciferol (25(O)D3: kalsifediol; Calderol) kom voor in die endoplasmiese retikulum van die lewer en word gekataliseer deur vitamien D 25-hidroksilase. Hierdie aktiveringsstap word nie deur plasmakalsiumkonsentrasies gereguleer nie. Die belangrikste sirkulerende vorm (10-80 μg/ml) is 25(O)D3, wat ook die primêre bergingsvorm van vitamien D is.
