برگرفته از کلسترول, ویتامین D از پروهورمون کوله کلسیفرول بیوسنتز می شود (D3), محصول تابش اشعه ماوراء بنفش خورشیدی 7-دهیدروکلسترول در پوست است. در 1966, ابتدا مشخص شد که ویتامین D باید از طریق دو مرحله متابولیک اکسیداتیو فعال شود. اولین اکسیداسیون به 25-هیدروکسی کوله کلسیفرول (25(اوه)D3: کلسیفدیول; کالدرول) در شبکه آندوپلاسمی کبد رخ می دهد و توسط ویتامین D 25 هیدروکسیلاز کاتالیز می شود.. این مرحله فعال سازی با غلظت کلسیم پلاسما تنظیم نمی شود. شکل عمده در گردش (10-80 میکروگرم بر میلی لیتر) است 25(اوه)D3, که همچنین شکل ذخیره سازی اولیه ویتامین D است.
