Izhaja iz holesterola, vitamin D se biosintetizira iz njegovega prohormona holekalciferola (D3), produkt sončnega ultravijoličnega obsevanja 7-dehidroholesterola v koži. notri 1966, prvič je bilo ugotovljeno, da se mora vitamin D aktivirati prek dveh oksidativnih presnovnih korakov. Prva oksidacija v 25-hidroksiholekalciferol (25(OH)D3: kalcifediol; Calderol) nastane v endoplazmatskem retikulumu jeter in ga katalizira 25-hidroksilaza vitamina D. Ta stopnja aktivacije ni regulirana s koncentracijo kalcija v plazmi. Glavna krožna oblika (10-80 μg/mL) je 25(OH)D3, ki je tudi primarna oblika shranjevanja vitamina D.
